В сотрудничестве между Институтом исследований мозга RIKEN и Центром наук о жизни в Японии ученые объединили передовые методы для получения полного каталога белков, которые производятся в определенных частях нейронов Пуркинье.
Исследование, возглавляемое доктором. Томас Лони, руководитель подразделения RIKEN BSI и Чарльз Плесси, руководитель подразделения RIKEN CLST, преуспели в идентификации нескольких тысяч РНК, обогащенных нейронами Пуркинье крысы. Этот исчерпывающий список содержит ключ к лучшему пониманию молекулярных событий в этих нейронах и потенциальному пониманию заболеваний, связанных с клетками Пуркинье, таких как атаксия (нарушения, влияющие на движение) и аутизм.
"Нейроны Пуркинье остаются одним из самых загадочных типов клеток мозга, они получают в 10 раз больше соединений, чем любой другой нейрон, и обладают уникальными среди нейронов структурными характеристиками," сказал доктор. Launey. Эти большие нейроны имеют отличительную форму с широко разветвленными расширениями, называемыми дендритами, которые принимают сигналы, и одним аксоном для отправки сигналов другим нейронам. В отличие от других тормозных нейронов, которые действуют локально на своих соседей, клетки Пуркинье отключают нейроны, расположенные за пределами коры мозжечка.
Доктора. Антон Кратц и Паскаль Бегин, соавторы исследования, и их коллеги определили не только, какие белки отличают клетки Пуркинье от других нейронов, но и какие белки образуются непосредственно в дендритах. Выделить дендриты и изучить их содержимое сложно, и исследователи совершили этот технический подвиг, используя сложные методы.
Хотя все клетки организма имеют одинаковую ДНК, они производят разные белки, которые придают им уникальные свойства, в зависимости от того, какие части генома активны. Чтобы сделать белки, информационная РНК (мРНК) несет информацию, закодированную в генах, от ядра до рибосом, механизма построения белков в цитоплазме. Комбинируя два высокопроизводительных метода, известных как TRAP (трансляция рибосомной аффинной очистки) и CAGEscan (Cap Analysis of Gene Expression, разработанный в RIKEN), исследователи могли специфически захватывать и идентифицировать мРНК, когда они транслировались в белки рибосомами у крыс. Нейроны Пуркинье.
Метод TRAP вводит метку в рибосому, и исследователи использовали биохимические методы для очистки меченых рибосом со связанной мРНК конкретно из клеток Пуркинье, показывая, какие белки производятся. Затем CAGEscan позволил им быстро секвенировать и идентифицировать огромное количество захваченных мРНК. Использование микродиссекции для отделения тела клетки от древовидных дендритов позволило исследователям идентифицировать белки, уникальные для каждого отдела. Они обнаружили, что существует множество различных видов белков, производимых специально в дендритах, отличных от тела клетки.
Этот почти исчерпывающий обзор молекулярного ландшафта позволил исследователям найти новые идентификаторы нейронов Пуркинье и ранее неизвестных мРНК. "Внедрение новых методов дало нам доступ к мРНК, которую часто трудно обнаружить, особенно к тем, которые малочисленны, но функционально важны, таким как мембранные рецепторы, переносчики и ионные каналы," сказал доктор. Launey.
Методы, используемые в этом исследовании, должны быть широко применимы к другим типам нейронов и другим млекопитающим, включая приматов, открывая путь для сравнительных исследований, которые могут выявить происхождение сложных когнитивных способностей или причинных дефектов заболеваний, влияющих на мозг.