Работа – сотрудничество между Вивианой Грэдинэру (БАКАЛАВР НАУК ’05), доцент биологии и биологической разработкой, и Фрэнсис Арнольд, доктором наук Дика и Барбары Дикинсон Химического машиностроения, Биохимии и Биоинженерии – было обрисовано в двух отдельных работах, размещённых в этом месяце.В то время, когда нейрон в покое, насосы и каналы в клеточной мембране сохраняют определенное для клетки равновесие положительно и отрицательно заряженные ионы в и за пределами клетки, приводящей к устойчивому мембранному напряжению, названному потенциалом спокойствия клетки. Но, в случае если стимул найден – к примеру, запах либо звук – наводнение ионов через сравнительно не так давно открытые каналы, вызывающие изменение в мембранном напряжении. Это изменение напряжения довольно часто проявляется как потенциал действия – нейронный импульс, что устанавливает деятельность схемы в перемещение.
Инструмент, созданный Грэдинэру и Арнольдом, обнаруживает и является маркёром этих трансформаций напряжения.«Отечественная безграничная цель для этого инструмента была в том, чтобы достигнуть ощущения нейронной деятельности с легкой а не классической электрофизиологией, но у данной цели было пара предпосылок», говорит Грэдинэру. «Датчик должен был быть стремительным, поскольку потенциалы действия происходят в легко миллисекундах. Помимо этого, датчик должен был быть весьма броским так, дабы сигнал мог быть обнаружен с существующими установками микроскопии.
И Вам нужно в один момент изучить многократные нейроны, каковые составляют нейронную сеть».Исследователи начали, оптимизировав Archaerhodopsin (Арка), светочувствительный белок от бактерий. По собственной природе, opsins как Арч выявляют солнечный свет и начинают перемещение микробов к свету так, дабы они имели возможность начать фотосинтез.
Но исследователи смогут кроме этого эксплуатировать легко-отзывчивые качества opsins для способа нейробиологии, названного оптогенетикой – в котором нейроны организма генетически модифицированы, дабы выразить эти микробные opsins. После этого легко проливая свет на поменянные нейроны, исследователи смогут руководить деятельностью клеток, и их связанных поведений в организме.Грэдинэру ранее спроектировал Арча для работы и лучшей терпимости в клетках млекопитающих, потому, что классический optogenetic инструмент раньше руководил поведением организма со светом. В то время, когда поменянные нейроны выставлены зеленому свету, действиям Арча как ингибитор, руководя таким образом – и нейронной деятельностью связанным поведениям – мешая тому, дабы нейроны стреляли.
Но Грэдинэру и Арнольд больше всего интересовались второй недвижимостью Арча: в то время, когда выставлено красному свету, белок действует как датчик напряжения, отвечая на трансформации в мембранных напряжениях, создавая вспышку света в присутствии потенциала действия. Не смотря на то, что эта собственность имела возможность в принципе разрешить Арчу обнаруживать деятельность сетей нейронов, световой сигнал, отмечающий эту нейронную деятельность, был довольно часто через чур тускл, дабы видеть.Дабы решить эту проблему, ее коллеги и Арнольд сделали белок Арча более броским применением способа названный направленной эволюцией – техника, которую Арнольд первоначально вел в начале 1990-х.
Исследователи ввели мутации в ген Арча, так кодируя миллионы вариантов белка. Они передали видоизмененные гены в E. coli клетки, каковые произвели белки мутанта, закодированные генами. Они тогда продемонстрировали тысячи получающихся E. coli колонии для интенсивности их флюоресценции. Гены для самых броских предположений были изолированы и подвергнуты предстоящим раундам мутагенеза и показывающий, пока бактерии не произвели белки, каковые были в 20 раз более броскими, чем уникальный белок Арча.
Работа, обрисовывающая яркие новые и процесс варианты белка, каковые были созданы, была размещена в выпуске 9 сентября Слушаний Национальной Академии наук.«Данный опыт демонстрирует, как скоро эти превосходные бактериальные белки смогут развиться в ответ на новые требования. Но еще более захватывающий то, что они смогут сделать в нейронах, потому, что Вивиана нашла», говорит Арнольд.В отдельном изучении во главе с аспирантами Грэдинэру Николасом Флицэнисом и Клэр Бедбрук, которая кроме этого рекомендуется Арнольдом, исследователи генетически включили новые, более броские варианты Арча в разъедающие нейроны в культуре, дабы видеть, какая из этих предположений была самой чувствительной к трансформациям напряжения – и исходя из этого будет лучшей при обнаружении потенциалов действия.
Один вариант, Archer1, не был лишь ярок и достаточно чувствителен, дабы отметить потенциалы действия в нейронах млекопитающих в реальном времени, он имел возможность кроме этого употребляться, дабы выяснить, какие конкретно нейроны были синаптическим образом связаны – и общающийся между собой – в схеме.Работа обрисована в изучении, опубликованном 15 сентября в издании Nature Communications.«Что было весьма интересно, то, что мы видели бы, что две клетки тут освещают, но не данный в том месте – по причине того, что первые два синаптическим образом связаны», говорит Грэдинэру. «Данный инструмент дал нам метод замечать сеть, где беспокойство одной клетки затрагивает другого».
Но чувство деятельности в живом организме и корреляция данной деятельности с поведением остались самой непростой задачей. Достигать данной команды Грэдинэру цели трудилось с Паулем Штернбергом, доктором наук Томаса Ханта Моргана Биологии, дабы проверить Archer1 как датчик в живом организме – маленький червь нематоды C. elegans. «Имеется пара обстоятельств, из-за чего мы применяли червей тут: они – сильные организмы для стремительной генной инженерии, и их ткани практически прозрачны, облегчая видеть флуоресцентный белок у живущего животного», говорит она.По окончании слияния Archer1 в нейроны, каковые были частью обонятельной совокупности червя – главного источника сенсорной информации для C. elegans – исследователи подвергли червя с приятным запахом. В то время, когда с приятным запахом находилось, основание, флуоресцентный сигнал был увиден, и в то время, когда с приятным запахом было удалено, исследователи видели, что схема нейронов осветила, подразумевая, что эти конкретные нейроны подавляются в присутствии стимула и активные в отсутствие стимула.
Опыт первенствовал разом, в то время, когда вариант Арча употреблялся, дабы замечать активную схему в живом организме.Gradinaru после этого сохраняет надежду применять инструменты как Archer1, дабы лучше осознать сложные нейронные сети млекопитающих, применяя микробный opsins в качестве чувствующих и приводящих в воздействие инструментов у optogenetically поменянных грызунов.«Для будущей работы полезно, что данный инструмент – bifunctional.
Не смотря на то, что Archer1 действует как датчик напряжения под красным светом с зеленым светом, это – ингибитор», говорит она. «И исходя из этого сейчас долговременная цель по отечественным опытам оптогенетики пребывает в том, дабы объединить инструменты с управляющими поведением особенностями и инструменты с чувствующими напряжение особенностями. Это разрешило бы нам приобретать все-оптический доступ к нейронным схемам. Но я пологаю, что имеется все еще громадная работа вперед».Одна цель для будущего, Грэдинэру говорит, пребывает в том, дабы сделать Archer1 еще более броский.
Не смотря на то, что флюоресценция белка возможно увидена через практически прозрачные ткани червя нематоды, непрозрачные органы, такие как мозг млекопитающих являются все еще проблемой. Больше работы, она говорит, должно будет быть сделано, перед тем как Archer1 имел возможность употребляться, дабы найти трансформации напряжения в нейронах проживания, ведущих себя млекопитающих.
И это потребует предстоящего сотрудничества с инженерами белка и биохимиками как Арнольд.«Как нейробиологи мы довольно часто сталкиваемся с экспериментальными барьерами, каковые открывают потенциал для новых способов.
Мы тогда сотрудничаем, дабы произвести инструменты через химию либо инструментовку, тогда мы утверждаем их и предлагаем оптимизацию, и это идти», говорит она. «Имеется пара вещей, что мы желали бы быть лучше, и при помощи этих многих тяжёлой работы и повторений, это может случиться».Работа, изданная в обеих газетах, была поддержана с грантами от Национальных Университетов Здоровья (NIH), включая Университет NIH/National Удара и Неврологических расстройств Новая Премия Новатора Gradinaru; финансирование Университета Бекмана для БИОНИЧЕСКОГО центра; гранты из Исследовательского управления армии США, и Грант Обучения Разделению Биологии Калифорнийского технологического университета и фонды запуска от Ректора и президента Калифорнийского технологического института и Биологической Разработки и Подразделения Биологии; и вторая Кея и Фонда финансовая поддержка Шерла Курчи и Исследовательский фонда Наук о жизни.